基因芯片［資料整理］

基因芯片的基本原理同芯片技術中雜交測序（sequencing by hybridization, SBH）。即任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個8 nt亞序列：
　　(1)　　　　　CTCATATG
　　(2)　　　　 GCTCATAT
　　(3)　　　　AGCTCATA
　　(4)　　　 TAGCTCAT
　　(5)　　　TTAGCTCA
　　這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊7個堿基。亞序列中A、T、C、G 4個堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補的雜交，那么48個8 nt亞序列探針中，僅有上述5個能同靶DNA雜交?？梢杂萌斯ず铣傻囊阎蛄械乃锌赡艿膎體寡核苷酸探針與一個未知的熒光標記DNA/RNA序列雜交，通過對雜交熒光信號檢測，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最后由計算機對大量熒光信號的譜型（pattern）數據進行分析，重構靶DNA 的互補寡核苷酸序列。

 基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，可以用下圖來說明。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據此可重組出靶核酸的序列。

基因芯片的測序原理圖

基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，可分為三種主要類型：1）固定在聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術進行檢測。這種方法的優點是所需檢測設備與目前分子生物學所用的放射顯影技術相一致,相對比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的需求量大，定量檢測存在較多問題。2）用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。這種方法點陣密度可有較大的提高，各個探針在表面上的結合量也比較一致，但在標準化和批量化生產方面仍有不易克服的困難。3）在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。該方法把微電子光刻技術與DNA化學合成技術相結合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實現標準化和批量化大規模生產，有著十分重要的發展潛力。

圖11-5-2 基因芯片原型

它是在基因探針的基礎上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測的物質，根據堿基互補的原理，利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析?；蛐酒ㄟ^應用平面微細加工技術和超分子自組裝技術，把大量分子檢測單元集成在一個微小的固體基片表面，可同時對大量的核酸和蛋白質等生物分子實現高效、快速、低成本的檢測和分析。

由于尚未形成主流技術，生物芯片的形式非常多，以基質材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等；以所檢測的生物信號種類分，有核酸、蛋白質、生物組織碎片甚至完整的活細胞；按工作原理分類，有雜交型、合成型、連接型、親和識別型等。由于生物芯片概念是隨著人類基因組的發展一起建立起來的，所以至今為止生物信號平行分析最成功的形式是以一種尼龍膜為基質的“cDNA陣列”，用于檢測生物樣品中基因表達譜的改變。

2.基因芯片技術基本過程

    生物芯片是將生命科學研究中所涉及的不連續的分析過程(如樣品制備、化學反應和分析檢測)，利用微電子、微機械、化學、物理技術、計算機技術在固體芯片表面構建的微流體分析單元和系統，使之連續化、集成化、微型化。

生物芯片技術主要包括四個基本要點：芯片方陣的構建、樣品的制備、生物分子反應和信號的檢測。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質分子按順序排列在片芯上。2、樣品制備，生物樣品往往是非常復雜的生物分子混合體，除少數特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應?？蓪悠愤M行生物處理，獲取其中的蛋白質或DNA、RNA，并且加以標記，以提高檢測的靈敏度。3、生物分子反應，芯片上的生物分子之間的反應是芯片檢測的關鍵一步。通過選擇合適的反應條件使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配比率。4、芯片信號檢測，常用的芯片信號檢測方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過掃描以獲得有關生物信息。

1 DNA方陣的構建

　　選擇硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龍膜等支持物，并作相應處理，然后采用光導化學合成和照相平板印刷技術可在硅片等表面合成寡核苷酸探針;（2）或者通過液相化學合成寡核苷酸鏈探針，或PCR技術擴增基因序列，再純化、定量分析，由陣列復制器（arraying and replicating device ARD），或陣列機（arrayer）及電腦控制的機器人，準確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應位置上，再由紫外線交聯固定后即得到DNA微陣列或芯片。

    基因芯片的制備主要有兩種基本方法，一是在片合成法，另一種方法是點樣法。在片合成法是基于組合化學的合成原理,它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學單體的偶聯位點和次序。在片合成法制備DNA芯片的關鍵是高空間分辨率的模板定位技術和固相合成化學技術的精巧結合。目前，已有多種模板技術用于基因芯片的在片合成,如光去保護并行合成法、光刻膠保護合成法、微流體模板固相合成技術、分子印章多次壓印原位合成的方法、噴印合成法。在片合成法可以發揮微細加工技術的優勢，很適合制作大規模DNA探針陣列芯片，實現高密度芯片的標準化和規?；a。美國Affymetrix公司制備的基因芯片產品在1.28*1.28cm²表面上可包含300,000個20至25mer寡核苷酸探針，每個探針單元的大小為10um X 10um。其實驗室芯片的陣列數已超過到1,000,000個探針。 

圖11-5-3 基因芯片在片合成原理圖

基因芯片點樣法首先按常規方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點,并通過物理和化學的結合使探針被固定于芯片的相應位點。這種方式較靈活，探針片段可來自多個途徑，除了可使用寡聚核苷酸探針，也可使用較長的基因片段以及核酸類似物探針（如PNA等）。探針制備方法可以用常規DNA探針合成方法、或PCR擴增的cDNA、EST文庫等。固定的方式也多種多樣。點樣法的優越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和儀器或cDNA探針庫，探針的長度可以任意選擇，且固定方法也比較成熟，靈活性大適合于研究單位根據需要自行制備科研型基因芯片，制作點陣規模較小的商品基因芯片。 

2 樣品DNA或mRNA的準備。

　　從血液或活組織中獲取的DNA/mRNA樣品在標記成為探針以前必須進行擴增提高閱讀靈敏度。Mosaic Technologies公司發展了一種固相PCR系統，好于傳統PCR技術，他們在靶DNA上設計一對雙向引物，將其排列在丙烯酰胺薄膜上，這種方法無交叉污染且省去液相處理的繁鎖；Lynx Therapeutics公司提出另一個革新的方法，即大規模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）這個方法可以對一個樣品中數以萬計的DNA片段同時進行克隆，且不必分離和單獨處理每個克隆，使樣品擴增更為有效快速。

　　在PCR擴增過程中，必須同時進行樣品標記，標記方法有熒光標記法、生物素標記法、同位素標記法等。

    與普通分子生物學實驗一樣，靶基因的制備需要運用常規手段從細胞和組織中提取模板分子，進行模板的擴增和標記?；蛐酒ù罅刻结樂肿樱虼耍谢驑悠返闹苽浞椒▽⒏鶕蛐酒念愋秃退芯康膶ο?如mRNA 、DNA等)而決定。對于大多數基因來說，mRNA 的表達水平大致與其蛋白質的水平相對應，因此，對細胞內mRNA 表達水平進行定量檢測對于了解細胞的性質與狀態十分重要。用基因芯片可以對細胞內大量基因的mRNA表達差異進行檢測，其靶基因的制備一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物進行擴增。

待測樣品的標記，主要采用熒光分子。常規標記的過程是通過在擴增過程中加入含有熒光標記的dNTP（至少一種為熒光標記的），熒光標記的單核苷酸分子，在轉錄和復制過程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進行分子雜交。也可采用末端標記法，直接在引物上標記熒光。即在引物合成時通過應用熒光標記的dNTP制備熒光標記引物，或通過標記生物素，進行熒光標記。

對于陣列密度較小的基因芯片(經常用膜片作為基底)可以用同位素檢測法，采用³²P標記技術，這樣可以運用現在普通使用的同位素顯影技術和儀器。但是，在使用同位素靶基因標記法過程中，一些表達量高雜交信號強的點陣，容易在其周圍產生光暈，當其周圍點陣的雜交信號較弱時，其雜交信號容易受到強雜交信號的掩蓋。

3 分子雜交

    cDNA基因芯片與靶基因的雜交過程與一般常規的分子雜交過程基本相同。在基因芯片的雜交檢測中，為了更好的比較不同來源樣品的基因表達差異，或者為了提高基因芯片檢測的準確性和測量范圍，通常使用多色熒光技術。即把不同來源的靶基因用不同激發波長的的熒光探針來修飾，并同時使它們與基因芯片雜交。通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖，可以直接獲得不同樣品中基因表達的差異。

人們還發展了其它靈敏度高、特異性好的基因芯片雜交檢測方法。例如短序列偶聯法。該方法首先將非標記的DNA靶序列與基因芯片上探針陣列進行完全雜交，若基因芯片上探針的固定端是5’端時，繼續以靶基因為模板，可以在暴露于溶液中的3’-OH上用DNA聚合酶合成上新的帶有熒光標記的堿基（ddNTPs）。通過檢測ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 

美國Nanogen公司提出了一種通過交變電場加速基因芯片的雜交速度的主動式基因芯片。他們利用核酸分子所帶的負電性質，通過快速反轉電場的極性，使靶基因與探針間產生快速結合和分離。通過控制電場的大小，使得完全匹配雜交的核酸分子保留在陣列表面，而非特異性結合的DNA在電場的作用下與探針分離。這種芯片的分子雜交速度可縮短至1分鐘以下甚至數秒（cheng et al，1998），因此有較廣闊的應用前景。

    樣品DNA與探針DNA互補雜交要根據探針的類型和長度以及芯片的應用來選擇、優化雜交條件。如用于基因表達監測，雜交的嚴格性較低、低溫、時間長、鹽濃度高；若用于突變檢測，則雜交條件相反。芯片分子雜交的特點是探針固化，樣品熒光標記，一次可以對大量生物樣品進行檢測分析，雜交過程只要30min。美國Nangon公司采用控制電場的方式，使分子雜交速度縮到1min，甚至幾秒鐘（6）。德國癌癥研究院的Jorg Hoheisel等認為以肽核酸（PNA）為探針效果更好。

4 雜交圖譜的檢測和分析

　　用激光激發芯片上的樣品發射熒光，嚴格配對的雜交分子，其熱力學穩定性較高，熒光強；不完全雜交的雙鍵分子熱力學穩定性低，熒光信號弱（不到前者的1/35~1/5），不雜交的無熒光。不同位點信號被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測到，由計算機軟件處理分析，得到有關基因圖譜。目前，如質譜法、化學發光法、光導纖維法等更靈敏`、快速，有取代熒光法的趨勢。

5.生物信息學與基因芯片

    生物信息學（Bioinformatics）是研究生物信息的采集、處理、存儲、傳播、分析和解釋等各方面的一門學科，它通過綜合利用生物學、計算機科學和信息技術而揭示大量而復雜的生物數據所賦有的生物學奧秘?；蚪M信息學、蛋白質空間結構模擬以及藥物設計構成了生物信息學的3個重要組成部分。從生物信息學研究的具體內容上看，生物信息學的應用與發展包括三個主要部分：(1)新算法和統計學方法研究；(2)各類數據的分析和解釋；(3)研制有效利用和管理數據新工具。
    基因芯片是基因表達譜數據的重要來源。目前生物信息學在基因芯片中的應用主要體現在三個方面。
1、確定芯片檢測目標。利用生物信息學方法，查詢生物分子信息數據庫，取得相應的序列數據，通過序列比對，找出特征序列，作為芯片設計的參照序列。   
2、芯片設計。主要包括兩個方面，即探針的設計和探針在芯片上的布局，必須根據具體的芯片功能、芯片制備技術采用不同的設計方法。
3、實驗數據管理與分析。 對基因芯片雜交圖像處理，給出實驗結果，并運用生物信息學方法對實驗進行可靠性分析，得到基因序列變異結果或基因表達分析結果。盡可能將實驗結果及分析結果存放在數據庫中，將基因芯片數據與公共數據庫進行鏈接，利用數據挖掘方法，揭示各種數據之間的關系

圖 基因芯片設計及信息處理

3.基因芯片的制造和種類

基因芯片的制造技術主要有原位合成技術和點樣技術。目前流行的基因芯片大致可分為以下四類：
(一).光引導原位合成DNA微陣列
    光引導聚合技術是原位合成的主要技術，照相平板印刷技術（photolithography）與傳統的核酸、多肽固相合成技術相結合的產物。半導體技術中曾使用照相平板技術法在半導體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術是當前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術成熟且已實現自動化。二者的結合為合成高密度核酸探針及短肽列陣提供了一條快捷的途徑。
光引導聚合技術是Affymetrix公司開發的專利技術，其光引導聚合技術制作DNA芯片，生產過程同電子芯片的生產過程十分相似。采用這種技術生產的基因芯片可以達到1×106/cm2的微探針排列密度，能夠在一片1厘米多見方的片基上排列幾百萬個寡聚核苷酸探針。并且其不僅可以用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。因此，Affymetrix公司也就成了基因芯片領域的“INTEL”。
      Affymetrix公司是第一家有商品化診斷芯片上市的公司，目前該公司上市 的基因芯片按用途可分為三大類，分別為基因表達芯片、基因多態性分析芯片和疾病診斷芯片，基因表達分析芯片和基因多態性分析芯片主要用于研究機構和生物制藥公司，可以用來尋找新基因、基因測序、疾病基因研究、基因制藥研究、新藥篩選等許多領域，Affymetrix公司主要生產通用寡聚核苷酸芯片；疾病診斷芯片則主要用于醫學臨床診斷，包括各種遺傳病和腫瘤等，目前Affymetrix公司生產三種商品化診斷芯片，分別為p53基因突變診斷芯片、艾滋病病毒基因基因突變診斷芯片和細胞色素P450基因突變診斷芯片。

(二).微電子芯片
    微電子芯片的多位點電控陣列并含獨立可尋址檢測區域的微電子基因芯片，其基質全部以硅、鍺與基礎的半導體材料，在其上構建25-400個微鉑電極位點，各位點可由計算機獨立或組合控制。無論在芯片制造或成品芯片檢測，均可通過相似微電極的電場變化來使核酸結合，引入"電子嚴謹度"參數使芯片檢測通過靶、探針序列特征和使用者要求來控制雜交過程中的嚴格性。這種微電子基因芯片具有以下優點：
      1．電場定位過程能選擇性地轉運帶電荷DNA分子，通過每個微電極位點的電場正負、強弱變化，能準確有效地隨意調控芯片表面的核酸，既可將核酸結合在微電極位點上，也可以使核酸轉運出來。
      2．通過電場變化能加快DNA雜交速率，通過導入正電場后，可以大大加快待測核酸同已知探針的結合速率，減少了雜交反應時間，同普通的"被動"雜交反應的幾小時相比，這種"主動"雜交反應僅僅幾秒鐘就可完成。另外電場變化又可有效地去除未結合游離分子，減少未結合熒光信號干擾。
    3．通過電子嚴謹度可有效地控制雜交過程中的錯配度，雜交錯配的程度，對不同的要求上要給以不同的電場就可以符合不同的電子嚴謹度，這對核酸雜交嚴格度可以非常靈活地控制，這可以非常準確地進行SNP檢測。
(三).微量點樣DNA微陣列
    微量點樣技術是目前大部分基因芯片公司使用的流行方法。就是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通過類似于Northern，Southern的方法與待測的標記樣品按堿基配對原理進行雜交，再通過檢測系統對其進行掃描，并用相應軟件對信號進行比較和檢測，得到所需的大量信息，進行基因的高通量、大規模、平行化、集約化的信息處理和功能研究。其主要優點是簡便宜行，技術要求較低，并且探針不受探針分子大小種類的限制，能夠靈活機動地根據使用者的要求制作出符合目的的芯片。目前國內生產研究中具有相當的市場。
    其實微量點樣DNA微陣列的制造和ELISA板的制造有相當的雷同，只是其包被的物不同，每一個小的點都相當于一個包被孔。因此，我們知道的一些ELISA包被問題，對微量點樣DNA微陣列的點樣也是同樣的。
    對于ELISA來說，尋找合適的載體是重要的，同樣微量點樣DNA微陣列也是如此。比較各種載體的優缺點，表面經過化學處理的玻片用得最多，主要是它具有其他載體所不能比擬的優點：DNA樣品可共價結合在玻片表面；玻片是一種持久的載體，它可耐受高溫和高離子強度；玻片具有不可浸潤性，使雜交體積降低到最小，因此提高了退火時的動力學參數；玻片的熒光信號本底低，不會造成很強的背景干擾；玻璃芯片可使用雙熒光甚至多熒光雜交系統，可在一個反應中同時對兩個以上的樣本進行平行處理。因此以玻璃為載體的芯片更具有發展和應用的前景。
    當然，點樣是整個流程中最重要的，微量點樣DNA微陣列的點樣是依靠點樣儀來完成的，各種點樣儀點樣原理和優點各有不同，生產這種設備的公司有很多，象美國的Genomicsolutions公司、英國的BioRobotics公司、美國的Cartesian公司和加拿大的Engineering公司等。
    對于微量點樣技術生產的基因芯片來說從儀器組成上可以分為點樣儀器、雜交裝置、檢測儀器和分析儀器，點樣儀器是否先進決定芯片上的探針密度和結合牢固程度，雖然芯片的探針密度是一個很重要的指標，達到極高密度的探針陣列是許多芯片生產公司夢寐以求的目標，但是具體的點樣密度根據使用者的目的來決定，而且還要考慮到隨后的雜交和檢測過程。衡量點樣裝置有幾個比較重要的指標，如儀器整體設計、功能多樣性、芯片基質多樣性、點樣穩定性、點樣速度、點樣密度等等。
    點陣器一般采用實心或空心點樣針，點樣方式有非接觸噴點（inkjet printing）和接觸點樣（Contact printing）兩種方式。目前，有兩種非接觸噴點技術用于DNA點樣，一種是用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術（piezoelectric technology），噴滴大小一般為50-500pl；另一種為注射器螺線管技術（syringe-solenoid technology），這種技術是通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機結合起來精確控制滴液的。

(四).其他
    除了，以上三種常用技術以外，還用美國NIH、Caliper公司和Orchidbio公司等的技術也有所不同。Orchidbio公司研制了一種毛細管微流泵芯片，在邊長2英寸的芯片上集成了144個微室，分別由流入孔、反應室、循環管和廢液流出孔組成，這種芯片不但可以用于基因診斷和分析，還可用于合成化學，就象一個微小的自動生化分析儀，呵呵。利用芯片的微指結構，Caliper公司的芯片可以用作細胞分選器，能夠利用血細胞體積和變形性等特點可以很容易地把紅細胞和白細胞分開.NIH研制微型芯片反應器可以很快地完成一系列生化反應。

4.基因芯片檢測原理

雜交信號的檢測是DNA芯片技術中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學發光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結構及性質，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規模DNA芯片由于其面積小，密度大，點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupled device camera，CCD)攝像機等弱光信號探測裝置。此外，大多數DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點以外還需要確定每一點上的信號強度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應也是非常重要的。雜交信號探測系統主要包括雜交信號產生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。

由于所使用的標記物不同，因而相應的探測方法也各具特色。大多數研究者使用熒光標記物，也有一些研究者使用生物素標記，聯合抗生物素結合物檢測DNA化學發光。通過檢測標記信號來確定DNA芯片雜交譜型。
    1．熒光標記雜交信號的檢測方法
    使用熒光標記物的研究者最多，因而相應的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發和探測樣品中的混合熒光標記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時，分辨能力在實際應用中可接近由數值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎。大多數方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎上發展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機的改進的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象 以熒光物質標記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經過SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。
    （1）激光掃描熒光顯微鏡
    探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經處理后固定在計算機控制的二維傳動平臺上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產生激發光經濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發熒光標記物產生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時通過同一物鏡收集熒光信號經另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經模數轉換板轉換為數字信號。通過計算機控制傳動平臺X－Y方向上步進平移，DNA芯片被逐點照射，所采集熒光信號構成雜交信號譜型，送計算機分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規模DNA芯片雜交信號檢測，廣泛應用于基因表達、基因診斷等方面研究。
    (2)激光掃描共焦顯微鏡
    激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結構非常相似，但是由于采用了共焦技術因而更具優越性。這種方法可以在熒光標記分子與DNA芯片雜交的同時進行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設計的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與DNA樣品雜交。當用激發光照射使熒光標記物產生熒光時，既有芯片上雜交的DNA樣品所發出的熒光，也有樣品地中DNA所發出的熒光，如何將兩者分離開來是一個非常重要的問題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號的同時，避開樣品池中熒光信號的影響。一般采用氬離子激光器（488nm）作為激發光源，經物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發的熒光再經同一物鏡收集，并經濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計數的模式下接收。經模數轉換反轉換為數字信號送微機處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發光焦平面以外的來自樣品池的未雜交分子熒光信號，避免其對探測結果的影響。激光器前也放置一個小孔光闌以盡量縮小聚焦點處光斑半徑，使之能夠只照射在單個探針上。通過計算機控制激光束或樣品池的移動，便可實現對芯片的二維掃描，移動步長與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，比較適合研究用?，F在 Affymetrix公司已推出商業化樣機，整套系統約 12萬美元。
    （3）采用了CCD相機的熒光顯微鏡
    這種探測裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于不是逐點激發探測，因而激發光照射光場為整個芯片區域，由CCD相機獲得整個DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發光源，由于激光束光強的高斯分布，會使得光場光強度分布不均，而熒光信號的強度與激發光的強度密切相關，因而不利于信號采集的線性響應。為保證激發光勻場照射，有的學者使用高壓汞燈經濾波片濾波，通過傳統的光學物鏡將激發光投射到芯片上，照明面積可通過更換物鏡來調整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結合傳輸激發光，并與芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時間可縮短至零點幾秒至十幾秒。其特點是掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用^[14].
    （4）光纖傳感器
    有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端），光纖維束的另一端（近端）經特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經化學方法拋光清潔?；瘜W方法合成的寡核苷酸探針共價結合于每根光纖的遠端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠端浸入到熒光標記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發熒光標記物產生熒光，仍用光纖維束傳導熒光信號返回到熒光顯微鏡，由CCD相機接收。每根光纖單獨作用互不干擾，而溶液中的熒光信號基本不會傳播到光纖中，雜交到光纖遠端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進而反復使用。這種方法快速、便捷，可實時檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數目有限，因而不便于制備大規模DNA芯片，有一定的應用局限性。

2.．生物素標記方法中的雜交信號探測
     以生物素（biotin）標記樣品的方法由來已久，通常都要聯合使用其它大分子與抗生物素的結合物（如結合化學發光底物酶、熒光素等），再利用所結合大分子的特殊性質得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標記的。

幾乎所有的檢測技術都可以用于基因芯片的檢測，比如常用的放射標記技術，熒光標記技術，質譜分析，化學發光等等都行。但是如果檢測儀器的分辨率不高，那么即使點樣儀器制造出了很高密度的芯片也沒有用，檢測儀器的分辨率是基因芯片的重要瓶頸。在基因芯片的顯色和測定方法中又以熒光標記技術最為常用。一般膜芯片的雜交都用同位素p32、p33作標記，其信號的檢測需通過傳統的磷光成像系統來完成，
    使用熒光標記的基因芯片，其檢測需要專用的熒光掃描儀測定。對于高密度的基因芯片目前最常用的是激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻CCD，二者各有利弊，須根據要求綜合衡量。其中又以高性能的冷卻CCD最為常用。
。
　　目前專用于熒光掃描的掃描儀大致分為兩類：一類是基于CCD（charge-coupled devices，電荷偶合裝置）的方法檢測光子；另一類則是基于PMT（photomultiplier tube，光電倍增管）的檢測系統。首先比較一下這兩種設備各自的優缺點：
　　CCD一次可成像很大面積的區域，而以PMT為基礎的熒光掃描儀則是以單束固定波長的激光來掃描，因此或者需要激光頭，或者需要目的芯片的機械運動來使激光掃到整個面積，這樣就需要耗費較多的時間來掃描；但是CCD有其缺點：目前性能最優越的CCD數字相機的成像面積只有16×12mm（像素為10μm），因此要達到整個芯片的面積20×60mm的話，需要數個數碼相機同時工作，或者也可以以降低分辨率為代價來獲得掃描精度不是很高的圖像。　　生產商業化掃描儀的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Beecher Instruments公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon Instruments公司等。
5.基因芯片的應用 

（一）基因表達分析　基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監測細胞中幾個至幾千個mRNA拷貝的轉錄情況。與用單探針分析mRNA的點雜交技術不同，基因芯片表達探針陣列應用了大約20對寡核苷酸探針來監測每一個mRNA的轉錄情況。每對探針中，包含一個與所要監測的mRNA完全吻合和一個不完全吻合的探針（圖2），這兩個探針的差別在于其中間位置的核苷酸不同。這種成對的探針可以將非特異性雜交和背景訊號減小到最低的水平，由此我們就可以確定那些低強度的mRNA。目前，Affymetrix公司已經生產出HugeneFL、Mu6500（含有小鼠6　500個基因）、Ye6100（含有酵母6　100個基因）等基因芯片成品。

  1　分析基因表達時空特征。英國劍橋大學Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人，應用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細胞基因組的調節周期。應用基因組水平的表達分析，監測那些表達受轉錄起始機制的關鍵成分控制的基因，發現RNA聚合酶II、主要的轉錄因子TFIID和SAGA染色體修飾復合物等均在基因的表達中有自己特定的作用位點[15]。通過本試驗，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉錄因子對表達的調控作用。（2）細胞在缺乏營養的環境中，基因不同位點的協同調節作用的全新機制。（3）信號轉導通路的最終作用位點，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗為基礎，研究人員進一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調節因子在基因上不同的作用位點和其作用的分子機制。
　　美國Stanford大學的V.R.Iyer等人[16]，對成纖維細胞中與細胞增生和損傷修復有關的基因進行了分析。首先，他們用成纖維細胞中的8　600個基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過與mRNA反轉錄形成的cDNA的雜交反應，可以判斷出該基因的活性。在試驗中，成纖維細胞被置于無營養的環境中，使絕大部分基因的活性關閉，兩天后，加入10%的血清，24小時內，分6個不同的時間點，觀察基因的活化情況。試驗結果表明，在所有被監測的基因中，約有500個基因最為活躍，而使細胞保持不分裂狀態的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉錄調控基因。在活化的基因中，有28個基因共同作用，控制細胞的增殖；8個與免疫反應的激活有關；19個與血管重建有關；另有許多基因，與血管新生密切相關。在腫瘤細胞中，基因的表達與正常的細胞存在著明顯的差異。通過基因芯片繪出基因表達的時空圖譜，有助于人類認識生命活動過程和特征。

2 基因差異表達檢測〔17〕　生命活動中基因表達的改變是生物學研究的核心問題。理解人類基因組中10萬個不同的基因功能，監測某些組織、細胞不同分化階段的差異基因表達（differential gene expression ，DGE）十分重要。對差異表達的研究，可以推斷基因與基因的相互關系，細胞分化中基因“開啟”或“關閉”的機制；揭示基因與疾病的發生、發展、轉歸的內在聯系。目前DGE研究方法主要有表達序列標簽（ESTs）測序、差減克?。╯ubtractive cloning ）、差異顯示（differential display）、基因表達系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術可監測大量mRNA的轉錄，直接快速地檢測出極其微量的mRNA，且易于同時監測成千上萬的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測胸膜間皮瘤與正常細胞間比較了6500個基因，，發現了300多個差異基因的表達。其中幾個典型基因的表達經RT-PCR進行定量后，可作為胸膜間皮瘤診斷的標記物（Markers）[18]。Sgroi〔19〕報告DNA芯片結合激光捕獲顯微切割技術（laser capture microdissection）用于乳癌浸潤期和轉移期及正常細胞的基因表達譜（gene expression profiles）差異研究，結果被定量PCR和免疫組化所證實。差異表達有助于早期發現瘤細胞3萬個基因與正常細胞的區別，有助于了解瘤細胞的發生、浸潤、轉移和藥敏。最近，美國毒物化學研究所（CIIT） 和國家環境健康科學研究所（NIEHS）正計劃在一張玻片上建立8 700個小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我國也已成功研制出能檢出41 000種基因表達譜的芯片。美國Stanford大學的David Botstein利用cDNA微陣列芯片，對乳腺癌細胞的基因表達進行了分析，發現其基因表達水平明顯低于正常細胞。利用基因芯片對表達進行分析，在一次試驗中可以獲取相當于在60余萬次傳統的Northern雜交中所獲得的關于基因表達的信息。通過這種實驗方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學方法，即依據每個腫瘤細胞中的基因表達情況對腫瘤細胞進行分類?；蛐酒夹g在分析基因的表達中具有不可比擬的優勢。
    3　發現新基因　Moch等利用腫瘤微陣列芯片（5 184個cDNA片段）發現了腎細胞癌的腫瘤標志物基因，并于正常細胞進行比較。在532份標本中檢測到胞漿纖維Vimentin的表達基因，陽性率為51%～61%〔20〕。追蹤觀察，有Vimentin表達的患者，預后極差。人類大量ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數據庫中400 000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析〔21〕。

定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發現可能的診斷及治療靶等方面是很有價值的。如該技術在炎癥性疾病類風濕性關節炎（RA）和炎癥性腸?。↖BD）的基因表達研究中，由RA或IBD組織制備探針，用Cy3和Cy5熒光素標記，然后與靶cDNA微陣列雜交，可檢測出炎癥疾病誘導的基因如TNF-α、IL或粒細胞集落刺激因子，同時發現一些以前未發現的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。Schena等人[22]報道了cDNA的微陣列在人類基因表達監測、生物學功能研究和基因發現方面的應用。采用含1,046個已知序列的cDNA微陣列，用高速機器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監測不同基因表達，在一定的實驗條件下，不同表達模式的陣列成分通過序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感10倍以上，檢測限度為1:500,000(wt/wt)總人體mRNA。在培養T細胞熱休克反應的測定中，發現17個陣列成分的熒光比較明顯改變，其中11個受熱休克處理的誘導，6個呈現中度抑制，對相應于17個陣列成分的cDNA測序發現5個表達最高的成分是5種熱休克蛋白，17個克隆中發現3個新序列。另外，在佛波酯誘導檢測中[23]，發現有6個陣列成分信號增強超過2倍，測序及數據庫比較揭示有5個已知的，誘導表達最高的兩個是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1，有一個是未知的。這4個新基因的表達水平均相對較低，僅呈現2倍的誘導。Northern雜交結果證實了微陣列的結果。進一步檢測了人的骨髓、腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調節基因的表達，4種組織中檢測出15種熱休克和佛波酯調節基因的表達，其表達水平與Jurkat細胞中相應成分的表達水平密切相關如在四種組織中表達水平最高的兩個基因β-actin和細胞色素C氧化酶在Jurkat細胞中的表達水平也很高。上述實驗提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發現和基因表達檢測。目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數據庫中400,000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。
    4　大規模DNA測序　人類基因組計劃的實施促進了高效的、自動化操作的測序方法的發展。芯片技術中雜交測序（sequencing by hybridization, SBH）技術及鄰堆雜交（contiguous stacking hybridization, CSH）技術即是一種新的高效快速測序方法[24-26]。用含65 536個8聚寡核苷酸的微陣列，采用SBH技術，可測定200 bp長DNA序列，采用67 108 864個13聚寡核苷酸的微陣列，可對數千個堿基長的DNA測序。SBH技術的效率隨著微陣列中寡核苷酸數量與長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數量與長度的增加則提高了微陣列的復雜性，降低了雜交準確性。CSH技術彌補了SBH技術存在的弊端，CSH技術的應用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行較長的DNA測序。計算機模擬論證了8聚寡核苷酸微陣列與5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當于13聚寡核苷酸微陣列的作用，可測定數千個核苷酸長的DNA序列[26]。Dubiley等人[26]將合成的10聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列（fractionation chips）進行單鏈DNA分離，再用測序微陣列（sequencing chips）分析序列，后者聯合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及與鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術。該方法可用于含重復序列及較長序列的DNA序列測定及不同基因組同源區域的序列比較。利用基因芯片測序的準確率達99%以上。

正如NIH首腦Harold Varmus在美國細胞生物學1998年年會上所說：“在基因芯片的幫助下，我們將能夠監測一個細胞乃至整個組織中所有基因的行為。”

（二）基因型、基因突變和多態性分析　

在同一物種不同種群和個體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關系。通過對大量具有不同性狀的個體的基因型進行比較，就可以得出基因與性狀的關系。但是，由于大多數性狀和遺傳性疾病是由多個基因同時決定的，因此分析起來就十分困難，然而基因芯片技術恰恰解決了這一問題，利用其可以同時反應數千甚至更多個基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關系。美國Stanford大學的E.A.Winzeler等[27]，以兩種不同菌株的酵母（S96和YJM789）作為實驗材料，對控制酵母對放線菌酮的抗藥性的基因進行分析。將含有酵母150 000個DNA片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉錄的mRNA分子雜交，S96幾乎全部吻合，而YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個位點沒有雜交顯色。由于S96對放線菌酮有抗藥性而YJM789的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所在。而后，通過對S96和YJM789雜交后產生的抗藥子代的遺傳標記的分析，進一步確定，控制該抗藥性的基因位于15號染色體，是一長約57 000個堿基的片斷。美國國家人類基因組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協助下[28]，將基因芯片應用于雙色突變分析。他們的分析對象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關的BRCA1基因的外顯子11。在擴增后，將BRCA1基因的外顯子11置于含有熒光素-12-UTP的環境中進行體外轉錄反應，而后將轉錄產生的mRNA與BRCA1外顯子11芯片雜交，4小時后，用藻紅蛋白染色。在觀察時，用488nm的氬離子激光進行掃描，熒光染色位點呈現綠色，而藻紅蛋白染色的位點呈現紅色。應用雙色分析，可以更為清楚的監測未知樣品與標準鏈之間的競爭性雜交情況，進而分析該基因中的不同突變。通過對15名患者BRCA1基因的觀察，有14名患者在外顯子11位點存在不同的突變。Hacia等［29］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個長度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1～5 bp)突變。針對每一個位點，共有28個獨立的探針，14個針對有義鏈，14個針對反義鏈。14個探針包括2個野生型，3個堿基置換、4個插入突變、5個堿基缺失。在15例患者樣品中，發現有14例有基因突變，類型包括點突變、插入及缺失等；在20例對照樣品中均未檢出假陽性結果，結果表明DNA芯片技術可快速、準確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等［30］分別用兩種DNA芯片檢測囊性纖維化跨膜傳導調節(CFTR)的突變，其中一個芯片包含1 480個探針，檢測了CFTR基因的第10和11外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了10個未知樣品的CFTR基因，其結果與PCR-RELP的分析結果完全一致。

Guo等人[31]利用結合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ASOs）微陣列建立了簡單快速的基因多態性分析方法。將ASOs共價固定于玻璃載片上，采用PCR擴增基因組DNA，其一條引物用熒光素標記，另一條引物用生物素標記，分離兩條互補的DNA鏈，將熒光素標記DNA鏈與微陣列雜交，通過熒光掃描檢測雜交模式，即可測定PCR產物存在的多種多態性，該方法對人的酪氨酸酶基因等4個外顯子內含有的5個單堿基突變進行分析，結果顯示單堿基錯配與完全匹配的雜交模式非常易于區別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。β-地中海貧血中變異的檢測也論證了該方法的有效性和可信性[32]。Lipshutz等人[33]采用含18,495個寡核苷酸探針的微陣列，對HIV-1基因組反轉錄酶基因（rt）及蛋白酶基因（pro）的高度多態性進行了篩選。微陣列中內部探針與靶序列的錯配具有明顯的不穩定性，據此可快速區別核酸靶的差異。例如檢測序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X堿基的種類，可用下列4種探針3'AGTCGTAACGGTAGC，3'AGTCGTACCGGTAGC，3'AGTCGTAGCGGTAGC，3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探針陣列可檢則具有特征性的較長序列相關的多態性與變異。篩選1,000個核苷酸序列的變異與多態性需要4,000個探針。用100μm合成位點，設計1.28cm2陣列，將有大約16,000個探針，能篩選4kb序列。HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易于發生多種變異，這些變異將導致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現明顯抗性，因此檢測和分析rt與pro的變異與多態性具有重要的臨床意義。隨著遺傳病與癌癥相關基因發現數量的增加，變異與多態性分析將越來越重要。Chee等［34］用含有1.35×105個長度為25 nt的寡核苷酸探針，分析了16.6 kb的人類線粒體基因組DNA(mt DNA)，共分析了10個樣本，檢測出了505個多態性位點，并在Leber′s遺傳性視神經疾病患者的mt DNA中檢測出3個致病性突變位點。

隨著人類基因組計劃的逐步發展，研究人員分析出了越來越多的基因序列。下一步，就是要分析這些基因的多態性與生物功能和疾病的關系，而這需要對大量個體進行分析。通過基因芯片SNP（單核苷酸多態性）定位試驗，可以確定基因多態性和疾病的關系，同時也可確定致病的機制和病人對治療的反應等。同樣，對于許多與人類疾病密切相關的致病微生物，也可對其進行基因型和多態性分析，1998年，法國T.Livache等[35]就成功的利用基因芯片技術，對人血中的HCV病毒進行了基因型分析。SNP基因芯片的成功將使臨床診斷上到一個新的臺階。

（三）疾病的診斷與治療　人類的疾病與遺傳基因密切相關，基因芯片可以對遺傳信息進行快速準確的分析，因此它在疾病的分子診斷中的優勢是不言而喻的，就臨床一種新的、強有力的分子工具[36]?；蛐酒夹g已經被應用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。
　　1　遺傳病相關基因的定位　90年代以來,隨著人類基因組計劃的發展,各種方法被相繼創立并應用到基因定位中。我國有4 000萬育齡婦女，每年有2 000萬新生兒，準確檢測遺傳病基因是優生優育的技術保障。DNA芯片充分結合并靈活運用了大規模集成電路制造技術、自動化技術、計算機及網絡技術、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標記探針、分子雜交及分子生物學的其它技術,在這一領域的研究中有著巨大的潛力。這一技術已成為基因定位研究的高效工具。隨著遺傳病與癌癥相關基因發現數量的增加，變異與多態性分析將越來越重要。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經濟快速又敏感可靠[37,38]。
    2　腫瘤診斷　已用基因芯片檢測人鼻咽癌、肺癌基因表達譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發現和定位。早在1996年，M.J.Kozal等就利用基因芯片[39]，對HIV-I B亞型中的蛋白酶基因的多態性進行了分析，這也是基因芯片技術被首次應用于臨床實踐。在艾滋病的治療中，使用HIV蛋白酶抑制劑是一種重要的手段。然而，病毒對該藥物的反應卻有著很大的差異。利用基因芯片技術，研究人員分析了取自102個病人的167個病毒單體，發現這些同為美國HIV-I B亞種的病毒的基因序列存在極大差異，其中蛋白酶的基因片斷差異最大，在編碼99個氨基酸的序列中，竟有47.5%存在明顯突變。這些氨基酸的突變，直接導致了病毒抗藥性的不同。含96 600個20體寡核苷酸高密度陣列對遺傳性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11個外顯子進行雜合變異篩選，15個患者的已知變異的樣品中，準確診斷出14個患者，20個對照樣品中未發現假陽性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP調查42例有乳癌史的家系，p53基因13 964位的G變為C，突變率為7.1%；無乳癌家族史者為0。Favis等用多位PCR/連接酶檢測反應（PCR/LDR）在一個試管內同時檢測數百個基因突變，用于檢測大腸癌組織k-ras 和p53突變及BRCA-1和BRCA-2低頻率突變收到良好效果。
    人類惡性腫瘤中，約有60%與人類p53抑癌基因的突變有關，目前研究人員已經研制成功了可以檢測p53基因所有編碼區（外顯子2～外顯子11）錯意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。以外顯子7的第248個密碼子為例，野生型為CGG，在芯片上做出5條探針，相應位點分別為GAC、GCC、GGC、GTC和G-C，根據雜交后的熒光顯色圖，就可以分析出該位點為何種突變。

3　感染性疾病的診斷　HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易于發生多種變異，這些變異將導致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現明顯抗性，因此檢測和分析rt與pro的變異與多態性具有重要的臨床意義。Hayward[40]以3 648個插入片段建立獵槍微陣列(shotgun microarray)，通過差異雜交和DNA測序找到了瘧原蟲無性和有性生殖階段基因差異表達，為抗瘧藥設計提供了線索?？梢灶A測在不久的將來，人們可望在一張DNA芯片上檢測幾乎所有的病原微生物基因，實現真正意義上的“組合檢測（profile tests）”。
    4　耐藥菌株和藥敏檢測　據WHO報告，全球每年約有800萬結核病患者，有300萬人死亡，死亡人數超過了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對不同的藥物產生了抗藥性（俄國80%TB對一種藥物產生抗性；美國50%為多重耐藥）。對每例患者進行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關鍵。最近，俄美兩國科學家開發了具此功能的基因芯片，可使醫生及早使用敏感藥物。該芯片（TB Biochips）將抗性菌株的單鏈DNA標記后固定在玻片上，與待檢TB株雜交，臨床使用未見假陽性，該芯片可清洗后重復使用50次。
    （四）藥物研究中的應用

從經濟效益來說，最大的應用領域可能是制藥廠用來開發新藥。所以已經有多家制藥企業介入芯片的開發。如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。對于尋找新藥來說，目標之一是應用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標。采用所謂“譯碼器”策略（Decoder strategy）來確定藥物靶標。從而找到“導向藥物”。基因芯片也被用于尋找蛋白激酶抑制物。細菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。
    1 新藥開發　高通量的DNA芯片可發現眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設計。噬菌體展示技術可創造大量蛋白質，目前多用于抗體庫的建立和篩選，進而可用于受體-配體相互作用的研究?；蚪M學、蛋白質組學和生物信息學（bioinformatics）將大大促進制藥工業的發展。目前第一個生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療，并獲得美國FDA的批準。除腫瘤外，用分子生物工程設計的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設計新的抗生素和工業用酶等。

同時，有時一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發現一種藥物的新的功能。原先設想的作用是針對某一靶標的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發現該藥在另一方面有很強的抑制作用，從而開發成另一種新藥。

2 調查藥物處理細胞后基因的表達情況
　　基因芯片在用來研究藥物的作用機理時十分有用。Marton[40]等人利用基因芯片構建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細胞后的基因表達圖譜。發現用FK506處理的酵母細胞基因表達圖譜與FK506靶標的無意義突變體相似。而用FK506去處理此突變體，發現了不同于野生型的作用機制。Clarke等［41］用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達情況，發現絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達增加。該研究提示，這類研究既有助于闡明藥物的作用機制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。
    3 對藥物進行毒性評價
　　應用芯片查找藥物的毒性或副作用，進行毒理學研究。尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表達的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達，則對它的深入研究就值得考慮。用芯片作大規模的表達研究往往可省略大量的動物試驗。若某個正在篩選的潛在藥物作用靶細胞得到的基因表達圖譜與已知的具有毒性副作用的藥物得到的基因表達圖譜相似時，就要考慮是否停止藥物開發（drug development）中花費巨大的臨床實驗階段。Nuwaysir等［42］研制了包括涉及細胞凋亡、DNA復制和修復、氧化應激/氧化還原內穩態、過氧化物酶體增殖反應、二英/多環芳烴反應、雌激素反應、看家基因、癌基因和抑癌基因、細胞周期控制、轉錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細胞色素P450等共2 090個基因的毒理芯片(ToxChip v1.0), 該芯片既可用于毒物的檢測和遺傳多態性的檢測，又可用于受檢毒物的毒作用機制的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫中選擇約600個與毒理學相關基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的毒理基因組學芯片，可研究肝臟毒性、內分泌干擾、致癌作用等毒性終點的作用機制，也可用于確定以基因表達模式為基礎的化合物的毒性。

（五）基因芯片中醫學領域中的應用

中醫學中應用基因芯片技術，還處于初始階段，目前主要集中以下三個方面：

1中藥的研究，具體的方法，同上述藥物篩選方法類似。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學過程均被大大簡化，將推動中藥的迅猛發展。中藥學引入基因芯片技術，將大大推動中藥研究的國際化進程，為闡明中藥作用機理，具有無可估量的重要意義。

2中醫“證”本質的研究。中醫“證”的中醫藥的臨床治療的核心，但“證”的本質研究一直難以有重大進展。主要因為中醫理論設及到生命的整體，因而它牽涉到許多基因和蛋白質，傳統的方法學無法弄清“證”的實質，而利用基因芯片技術，對不同“證”狀態的基因組進行掃描，再繪出不同證的基因表達譜，通過相關分析，可望獲得一些有意義的成果。也是從分子基因水平全面揭示“證”本質提供了可能。如果證本質被揭示，它可能會引起醫學治療學理論的重大革新或變化，尤其是個體化治療方案可能重新被重視。

3針灸原理研究。針灸的原理設及全身各個部分，針灸不同方法、不同穴位、經絡是否具有不同的作用，也即經脈與臟腑間的相關聯系是否具有相對特異性。通過基因芯片測量不同組織基因表達的差異，判斷基因表達是否具有特異性，有望解決這一長期爭論不休的問題。如果心經與心臟具有相對特異性，那么針刺心經后，心臟內可能會出現某些與針刺相關的特異性基因表達，而且，這種表達只在針刺心經時出現，這些基因可能不在其它器官，如肝臟中表達。那么可以肯定地認為經脈臟腑相關是具有相對特異性的，也可以認為傳統經絡理論是有依據的。

另一方面，基因芯片還有助于揭示針灸的作用機制。針灸的作用是與神經內分泌免疫網絡系統（NEI networks）密切相關的，它設及到細胞信使、神經遞質、調質、神經肽、細胞因子、內分泌激素等多種因子，但針灸的信號是如何在細胞間和細胞內傳遞的過程仍不明朗，如果引入基因芯片，可以高通量的檢測細胞內基因表達的時空特征，有助于了解針灸促進基因表達的特點，進而再利用蛋白組學相關技術，揭示針灸作用原理?，F在已有部分工作正在進行。

    （六）其它應用

  1環境化學毒物的篩選　我們的生活環境中存在著數千種化學物質，每種物質在投入使用前必須進行人體毒性試驗，傳統的動物試驗費用高昂，且存在著國際上關注的動物福利（animal welfare）問題。采用毒物檢測芯片（Toxchips）可對環境中眾多化學物質對人類基因的潛在毒性進行篩選，探查毒物“開啟”或“關閉”哪些基因，研究“環境如何改變我們的基因”。NIEHS將對人類100 000個基因中的12 000個基因進行檢測，弄清致癌物質對基因的改變，建立化學物質指紋庫（fingerprints of chemicals），然后即可通過測定特定基因的突變與否判斷新的合成物質的生物毒性。

  2體質醫學的研究。體質醫學關系到個體化治療的核心問題，不同的人具有不同的體質基礎，其原因與基因型可能存在一定的相關性，尤其可能與SNP關系較大，如何全面了解人的SNP差異，以及它與體質因素、疾病的易感性間關系，是值得研究的重大課題。

posted on 2007-04-28 11:10 ashura 閱讀(1811) 評論(0)  編輯 收藏 引用 所屬分類: Bioinformation