基因芯片［資料整理］

基因芯片的基本原理同芯片技術(shù)中雜交測(cè)序（sequencing by hybridization, SBH）。即任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個(gè)8 nt亞序列：
　　(1)　　　　　CTCATATG
　　(2)　　　　 GCTCATAT
　　(3)　　　　AGCTCATA
　　(4)　　　 TAGCTCAT
　　(5)　　　TTAGCTCA
　　這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中A、T、C、G 4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8 nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶DNA雜交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過(guò)對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶DNA 的互補(bǔ)寡核苷酸序列。

 基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，可以用下圖來(lái)說(shuō)明。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過(guò)確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

基因芯片的測(cè)序原理圖

基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，可分為三種主要類型：1）固定在聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所需檢測(cè)設(shè)備與目前分子生物學(xué)所用的放射顯影技術(shù)相一致,相對(duì)比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的需求量大，定量檢測(cè)存在較多問題。2）用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過(guò)與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。這種方法點(diǎn)陣密度可有較大的提高，各個(gè)探針在表面上的結(jié)合量也比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。3）在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。該方法把微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖11-5-2 基因芯片原型

它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測(cè)的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針到基因混合物中識(shí)別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析。基因芯片通過(guò)應(yīng)用平面微細(xì)加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù)，把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析。

由于尚未形成主流技術(shù)，生物芯片的形式非常多，以基質(zhì)材料分，有尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等；以所檢測(cè)的生物信號(hào)種類分，有核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片甚至完整的活細(xì)胞；按工作原理分類，有雜交型、合成型、連接型、親和識(shí)別型等。由于生物芯片概念是隨著人類基因組的發(fā)展一起建立起來(lái)的，所以至今為止生物信號(hào)平行分析最成功的形式是以一種尼龍膜為基質(zhì)的“cDNA陣列”，用于檢測(cè)生物樣品中基因表達(dá)譜的改變。

2.基因芯片技術(shù)基本過(guò)程

    生物芯片是將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過(guò)程(如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè))，利用微電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。

生物芯片技術(shù)主要包括四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì)分子按順序排列在片芯上。2、樣品制備，生物樣品往往是非常復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)。可將樣品進(jìn)行生物處理，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，并且加以標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度。3、生物分子反應(yīng)，芯片上的生物分子之間的反應(yīng)是芯片檢測(cè)的關(guān)鍵一步。通過(guò)選擇合適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配比率。4、芯片信號(hào)檢測(cè)，常用的芯片信號(hào)檢測(cè)方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過(guò)掃描以獲得有關(guān)生物信息。

1 DNA方陣的構(gòu)建

　　選擇硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龍膜等支持物，并作相應(yīng)處理，然后采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)可在硅片等表面合成寡核苷酸探針;（2）或者通過(guò)液相化學(xué)合成寡核苷酸鏈探針，或PCR技術(shù)擴(kuò)增基因序列，再純化、定量分析，由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device ARD），或陣列機(jī)（arrayer）及電腦控制的機(jī)器人，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。

    基因芯片的制備主要有兩種基本方法，一是在片合成法，另一種方法是點(diǎn)樣法。在片合成法是基于組合化學(xué)的合成原理,它通過(guò)一組定位模板來(lái)決定基片表面上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。目前，已有多種模板技術(shù)用于基因芯片的在片合成,如光去保護(hù)并行合成法、光刻膠保護(hù)合成法、微流體模板固相合成技術(shù)、分子印章多次壓印原位合成的方法、噴印合成法。在片合成法可以發(fā)揮微細(xì)加工技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，很適合制作大規(guī)模DNA探針陣列芯片，實(shí)現(xiàn)高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。美國(guó)Affymetrix公司制備的基因芯片產(chǎn)品在1.28*1.28cm²表面上可包含300,000個(gè)20至25mer寡核苷酸探針，每個(gè)探針單元的大小為10um X 10um。其實(shí)驗(yàn)室芯片的陣列數(shù)已超過(guò)到1,000,000個(gè)探針。 

圖11-5-3 基因芯片在片合成原理圖

基因芯片點(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫(kù)，然后通過(guò)特殊的針頭和微噴頭, 分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn),并通過(guò)物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。這種方式較靈活，探針片段可來(lái)自多個(gè)途徑，除了可使用寡聚核苷酸探針，也可使用較長(zhǎng)的基因片段以及核酸類似物探針（如PNA等）。探針制備方法可以用常規(guī)DNA探針合成方法、或PCR擴(kuò)增的cDNA、EST文庫(kù)等。固定的方式也多種多樣。點(diǎn)樣法的優(yōu)越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和儀器或cDNA探針庫(kù)，探針的長(zhǎng)度可以任意選擇，且固定方法也比較成熟，靈活性大適合于研究單位根據(jù)需要自行制備科研型基因芯片，制作點(diǎn)陣規(guī)模較小的商品基因芯片。 

2 樣品DNA或mRNA的準(zhǔn)備。

　　從血液或活組織中獲取的DNA/mRNA樣品在標(biāo)記成為探針以前必須進(jìn)行擴(kuò)增提高閱讀靈敏度。Mosaic Technologies公司發(fā)展了一種固相PCR系統(tǒng)，好于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，他們?cè)诎蠨NA上設(shè)計(jì)一對(duì)雙向引物，將其排列在丙烯酰胺薄膜上，這種方法無(wú)交叉污染且省去液相處理的繁鎖；Lynx Therapeutics公司提出另一個(gè)革新的方法，即大規(guī)模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）這個(gè)方法可以對(duì)一個(gè)樣品中數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA片段同時(shí)進(jìn)行克隆，且不必分離和單獨(dú)處理每個(gè)克隆，使樣品擴(kuò)增更為有效快速。

　　在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，必須同時(shí)進(jìn)行樣品標(biāo)記，標(biāo)記方法有熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法等。

    與普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一樣，靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和標(biāo)記。基因芯片包括大量探針分子，因此，靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對(duì)象(如mRNA 、DNA等)而決定。對(duì)于大多數(shù)基因來(lái)說(shuō)，mRNA 的表達(dá)水平大致與其蛋白質(zhì)的水平相對(duì)應(yīng)，因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)對(duì)于了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)十分重要。用基因芯片可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量基因的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，其靶基因的制備一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

待測(cè)樣品的標(biāo)記，主要采用熒光分子。常規(guī)標(biāo)記的過(guò)程是通過(guò)在擴(kuò)增過(guò)程中加入含有熒光標(biāo)記的dNTP（至少一種為熒光標(biāo)記的），熒光標(biāo)記的單核苷酸分子，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進(jìn)行分子雜交。也可采用末端標(biāo)記法，直接在引物上標(biāo)記熒光。即在引物合成時(shí)通過(guò)應(yīng)用熒光標(biāo)記的dNTP制備熒光標(biāo)記引物，或通過(guò)標(biāo)記生物素，進(jìn)行熒光標(biāo)記。

對(duì)于陣列密度較小的基因芯片(經(jīng)常用膜片作為基底)可以用同位素檢測(cè)法，采用³²P標(biāo)記技術(shù)，這樣可以運(yùn)用現(xiàn)在普通使用的同位素顯影技術(shù)和儀器。但是，在使用同位素靶基因標(biāo)記法過(guò)程中，一些表達(dá)量高雜交信號(hào)強(qiáng)的點(diǎn)陣，容易在其周圍產(chǎn)生光暈，當(dāng)其周圍點(diǎn)陣的雜交信號(hào)較弱時(shí)，其雜交信號(hào)容易受到強(qiáng)雜交信號(hào)的掩蓋。

3 分子雜交

    cDNA基因芯片與靶基因的雜交過(guò)程與一般常規(guī)的分子雜交過(guò)程基本相同。在基因芯片的雜交檢測(cè)中，為了更好的比較不同來(lái)源樣品的基因表達(dá)差異，或者為了提高基因芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和測(cè)量范圍，通常使用多色熒光技術(shù)。即把不同來(lái)源的靶基因用不同激發(fā)波長(zhǎng)的的熒光探針來(lái)修飾，并同時(shí)使它們與基因芯片雜交。通過(guò)比較芯片上不同波長(zhǎng)熒光的分布圖，可以直接獲得不同樣品中基因表達(dá)的差異。

人們還發(fā)展了其它靈敏度高、特異性好的基因芯片雜交檢測(cè)方法。例如短序列偶聯(lián)法。該方法首先將非標(biāo)記的DNA靶序列與基因芯片上探針陣列進(jìn)行完全雜交，若基因芯片上探針的固定端是5’端時(shí)，繼續(xù)以靶基因?yàn)槟０澹梢栽诒┞队谌芤褐械?’-OH上用DNA聚合酶合成上新的帶有熒光標(biāo)記的堿基（ddNTPs）。通過(guò)檢測(cè)ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 

美國(guó)Nanogen公司提出了一種通過(guò)交變電場(chǎng)加速基因芯片的雜交速度的主動(dòng)式基因芯片。他們利用核酸分子所帶的負(fù)電性質(zhì)，通過(guò)快速反轉(zhuǎn)電場(chǎng)的極性，使靶基因與探針間產(chǎn)生快速結(jié)合和分離。通過(guò)控制電場(chǎng)的大小，使得完全匹配雜交的核酸分子保留在陣列表面，而非特異性結(jié)合的DNA在電場(chǎng)的作用下與探針分離。這種芯片的分子雜交速度可縮短至1分鐘以下甚至數(shù)秒（cheng et al，1998），因此有較廣闊的應(yīng)用前景。

    樣品DNA與探針DNA互補(bǔ)雜交要根據(jù)探針的類型和長(zhǎng)度以及芯片的應(yīng)用來(lái)選擇、優(yōu)化雜交條件。如用于基因表達(dá)監(jiān)測(cè)，雜交的嚴(yán)格性較低、低溫、時(shí)間長(zhǎng)、鹽濃度高；若用于突變檢測(cè)，則雜交條件相反。芯片分子雜交的特點(diǎn)是探針固化，樣品熒光標(biāo)記，一次可以對(duì)大量生物樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，雜交過(guò)程只要30min。美國(guó)Nangon公司采用控制電場(chǎng)的方式，使分子雜交速度縮到1min，甚至幾秒鐘（6）。德國(guó)癌癥研究院的Jorg Hoheisel等認(rèn)為以肽核酸（PNA）為探針效果更好。

4 雜交圖譜的檢測(cè)和分析

　　用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強(qiáng)；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5），不雜交的無(wú)熒光。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析，得到有關(guān)基因圖譜。目前，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等更靈敏`、快速，有取代熒光法的趨勢(shì)。

5.生物信息學(xué)與基因芯片

    生物信息學(xué)（Bioinformatics）是研究生物信息的采集、處理、存儲(chǔ)、傳播、分析和解釋等各方面的一門學(xué)科，它通過(guò)綜合利用生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)而揭示大量而復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)所賦有的生物學(xué)奧秘。基因組信息學(xué)、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬以及藥物設(shè)計(jì)構(gòu)成了生物信息學(xué)的3個(gè)重要組成部分。從生物信息學(xué)研究的具體內(nèi)容上看，生物信息學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展包括三個(gè)主要部分：(1)新算法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究；(2)各類數(shù)據(jù)的分析和解釋；(3)研制有效利用和管理數(shù)據(jù)新工具。
    基因芯片是基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的重要來(lái)源。目前生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在三個(gè)方面。
1、確定芯片檢測(cè)目標(biāo)。利用生物信息學(xué)方法，查詢生物分子信息數(shù)據(jù)庫(kù)，取得相應(yīng)的序列數(shù)據(jù)，通過(guò)序列比對(duì)，找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。   
2、芯片設(shè)計(jì)。主要包括兩個(gè)方面，即探針的設(shè)計(jì)和探針在芯片上的布局，必須根據(jù)具體的芯片功能、芯片制備技術(shù)采用不同的設(shè)計(jì)方法。
3、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與分析。 對(duì)基因芯片雜交圖像處理，給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行可靠性分析，得到基因序列變異結(jié)果或基因表達(dá)分析結(jié)果。盡可能將實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析結(jié)果存放在數(shù)據(jù)庫(kù)中，將基因芯片數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鏈接，利用數(shù)據(jù)挖掘方法，揭示各種數(shù)據(jù)之間的關(guān)系

圖 基因芯片設(shè)計(jì)及信息處理

3.基因芯片的制造和種類

基因芯片的制造技術(shù)主要有原位合成技術(shù)和點(diǎn)樣技術(shù)。目前流行的基因芯片大致可分為以下四類：
(一).光引導(dǎo)原位合成DNA微陣列
    光引導(dǎo)聚合技術(shù)是原位合成的主要技術(shù)，照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。半導(dǎo)體技術(shù)中曾使用照相平板技術(shù)法在半導(dǎo)體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術(shù)是當(dāng)前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術(shù)成熟且已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽列陣提供了一條快捷的途徑。
光引導(dǎo)聚合技術(shù)是Affymetrix公司開發(fā)的專利技術(shù)，其光引導(dǎo)聚合技術(shù)制作DNA芯片，生產(chǎn)過(guò)程同電子芯片的生產(chǎn)過(guò)程十分相似。采用這種技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片可以達(dá)到1×106/cm2的微探針排列密度，能夠在一片1厘米多見方的片基上排列幾百萬(wàn)個(gè)寡聚核苷酸探針。并且其不僅可以用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。因此，Affymetrix公司也就成了基因芯片領(lǐng)域的“INTEL”。
      Affymetrix公司是第一家有商品化診斷芯片上市的公司，目前該公司上市 的基因芯片按用途可分為三大類，分別為基因表達(dá)芯片、基因多態(tài)性分析芯片和疾病診斷芯片，基因表達(dá)分析芯片和基因多態(tài)性分析芯片主要用于研究機(jī)構(gòu)和生物制藥公司，可以用來(lái)尋找新基因、基因測(cè)序、疾病基因研究、基因制藥研究、新藥篩選等許多領(lǐng)域，Affymetrix公司主要生產(chǎn)通用寡聚核苷酸芯片；疾病診斷芯片則主要用于醫(yī)學(xué)臨床診斷，包括各種遺傳病和腫瘤等，目前Affymetrix公司生產(chǎn)三種商品化診斷芯片，分別為p53基因突變?cè)\斷芯片、艾滋病病毒基因基因突變?cè)\斷芯片和細(xì)胞色素P450基因突變?cè)\斷芯片。

(二).微電子芯片
    微電子芯片的多位點(diǎn)電控陣列并含獨(dú)立可尋址檢測(cè)區(qū)域的微電子基因芯片，其基質(zhì)全部以硅、鍺與基礎(chǔ)的半導(dǎo)體材料，在其上構(gòu)建25-400個(gè)微鉑電極位點(diǎn)，各位點(diǎn)可由計(jì)算機(jī)獨(dú)立或組合控制。無(wú)論在芯片制造或成品芯片檢測(cè)，均可通過(guò)相似微電極的電場(chǎng)變化來(lái)使核酸結(jié)合，引入"電子嚴(yán)謹(jǐn)度"參數(shù)使芯片檢測(cè)通過(guò)靶、探針序列特征和使用者要求來(lái)控制雜交過(guò)程中的嚴(yán)格性。這種微電子基因芯片具有以下優(yōu)點(diǎn)：
      1．電場(chǎng)定位過(guò)程能選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)帶電荷DNA分子，通過(guò)每個(gè)微電極位點(diǎn)的電場(chǎng)正負(fù)、強(qiáng)弱變化，能準(zhǔn)確有效地隨意調(diào)控芯片表面的核酸，既可將核酸結(jié)合在微電極位點(diǎn)上，也可以使核酸轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)。
      2．通過(guò)電場(chǎng)變化能加快DNA雜交速率，通過(guò)導(dǎo)入正電場(chǎng)后，可以大大加快待測(cè)核酸同已知探針的結(jié)合速率，減少了雜交反應(yīng)時(shí)間，同普通的"被動(dòng)"雜交反應(yīng)的幾小時(shí)相比，這種"主動(dòng)"雜交反應(yīng)僅僅幾秒鐘就可完成。另外電場(chǎng)變化又可有效地去除未結(jié)合游離分子，減少未結(jié)合熒光信號(hào)干擾。
    3．通過(guò)電子嚴(yán)謹(jǐn)度可有效地控制雜交過(guò)程中的錯(cuò)配度，雜交錯(cuò)配的程度，對(duì)不同的要求上要給以不同的電場(chǎng)就可以符合不同的電子嚴(yán)謹(jǐn)度，這對(duì)核酸雜交嚴(yán)格度可以非常靈活地控制，這可以非常準(zhǔn)確地進(jìn)行SNP檢測(cè)。
(三).微量點(diǎn)樣DNA微陣列
    微量點(diǎn)樣技術(shù)是目前大部分基因芯片公司使用的流行方法。就是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物（如膜、硅片、陶瓷片及玻片）上，然后通過(guò)類似于Northern，Southern的方法與待測(cè)的標(biāo)記樣品按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行掃描，并用相應(yīng)軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行比較和檢測(cè)，得到所需的大量信息，進(jìn)行基因的高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究。其主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便宜行，技術(shù)要求較低，并且探針不受探針分子大小種類的限制，能夠靈活機(jī)動(dòng)地根據(jù)使用者的要求制作出符合目的的芯片。目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)研究中具有相當(dāng)?shù)氖袌?chǎng)。
    其實(shí)微量點(diǎn)樣DNA微陣列的制造和ELISA板的制造有相當(dāng)?shù)睦淄皇瞧浒坏奈锊煌恳粋€(gè)小的點(diǎn)都相當(dāng)于一個(gè)包被孔。因此，我們知道的一些ELISA包被問題，對(duì)微量點(diǎn)樣DNA微陣列的點(diǎn)樣也是同樣的。
    對(duì)于ELISA來(lái)說(shuō)，尋找合適的載體是重要的，同樣微量點(diǎn)樣DNA微陣列也是如此。比較各種載體的優(yōu)缺點(diǎn)，表面經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的玻片用得最多，主要是它具有其他載體所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)：DNA樣品可共價(jià)結(jié)合在玻片表面；玻片是一種持久的載體，它可耐受高溫和高離子強(qiáng)度；玻片具有不可浸潤(rùn)性，使雜交體積降低到最小，因此提高了退火時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)；玻片的熒光信號(hào)本底低，不會(huì)造成很強(qiáng)的背景干擾；玻璃芯片可使用雙熒光甚至多熒光雜交系統(tǒng)，可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)對(duì)兩個(gè)以上的樣本進(jìn)行平行處理。因此以玻璃為載體的芯片更具有發(fā)展和應(yīng)用的前景。
    當(dāng)然，點(diǎn)樣是整個(gè)流程中最重要的，微量點(diǎn)樣DNA微陣列的點(diǎn)樣是依靠點(diǎn)樣儀來(lái)完成的，各種點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣原理和優(yōu)點(diǎn)各有不同，生產(chǎn)這種設(shè)備的公司有很多，象美國(guó)的Genomicsolutions公司、英國(guó)的BioRobotics公司、美國(guó)的Cartesian公司和加拿大的Engineering公司等。
    對(duì)于微量點(diǎn)樣技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片來(lái)說(shuō)從儀器組成上可以分為點(diǎn)樣儀器、雜交裝置、檢測(cè)儀器和分析儀器，點(diǎn)樣儀器是否先進(jìn)決定芯片上的探針密度和結(jié)合牢固程度，雖然芯片的探針密度是一個(gè)很重要的指標(biāo)，達(dá)到極高密度的探針陣列是許多芯片生產(chǎn)公司夢(mèng)寐以求的目標(biāo)，但是具體的點(diǎn)樣密度根據(jù)使用者的目的來(lái)決定，而且還要考慮到隨后的雜交和檢測(cè)過(guò)程。衡量點(diǎn)樣裝置有幾個(gè)比較重要的指標(biāo)，如儀器整體設(shè)計(jì)、功能多樣性、芯片基質(zhì)多樣性、點(diǎn)樣穩(wěn)定性、點(diǎn)樣速度、點(diǎn)樣密度等等。
    點(diǎn)陣器一般采用實(shí)心或空心點(diǎn)樣針，點(diǎn)樣方式有非接觸噴點(diǎn)（inkjet printing）和接觸點(diǎn)樣（Contact printing）兩種方式。目前，有兩種非接觸噴點(diǎn)技術(shù)用于DNA點(diǎn)樣，一種是用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術(shù)（piezoelectric technology），噴滴大小一般為50-500pl；另一種為注射器螺線管技術(shù)（syringe-solenoid technology），這種技術(shù)是通過(guò)高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機(jī)結(jié)合起來(lái)精確控制滴液的。

(四).其他
    除了，以上三種常用技術(shù)以外，還用美國(guó)NIH、Caliper公司和Orchidbio公司等的技術(shù)也有所不同。Orchidbio公司研制了一種毛細(xì)管微流泵芯片，在邊長(zhǎng)2英寸的芯片上集成了144個(gè)微室，分別由流入孔、反應(yīng)室、循環(huán)管和廢液流出孔組成，這種芯片不但可以用于基因診斷和分析，還可用于合成化學(xué)，就象一個(gè)微小的自動(dòng)生化分析儀，呵呵。利用芯片的微指結(jié)構(gòu)，Caliper公司的芯片可以用作細(xì)胞分選器，能夠利用血細(xì)胞體積和變形性等特點(diǎn)可以很容易地把紅細(xì)胞和白細(xì)胞分開.NIH研制微型芯片反應(yīng)器可以很快地完成一系列生化反應(yīng)。

4.基因芯片檢測(cè)原理

雜交信號(hào)的檢測(cè)是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測(cè)分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。

由于所使用的標(biāo)記物不同，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也各具特色。大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo)記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測(cè)DNA化學(xué)發(fā)光。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)來(lái)確定DNA芯片雜交譜型。
    1．熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法
    使用熒光標(biāo)記物的研究者最多，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測(cè)樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長(zhǎng)決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機(jī)的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對(duì)象 以熒光物質(zhì)標(biāo)記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經(jīng)過(guò)SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。
    （1）激光掃描熒光顯微鏡
    探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。
    (2)激光掃描共焦顯微鏡
    激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設(shè)計(jì)的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與DNA樣品雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的DNA樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中DNA所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開來(lái)是一個(gè)非常重要的問題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號(hào)的同時(shí)，避開樣品池中熒光信號(hào)的影響。一般采用氬離子激光器（488nm）作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計(jì)數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)送微機(jī)處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來(lái)自樣品池的未雜交分子熒光信號(hào)，避免其對(duì)探測(cè)結(jié)果的影響。激光器前也放置一個(gè)小孔光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處光斑半徑，使之能夠只照射在單個(gè)探針上。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合研究用。現(xiàn)在 Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12萬(wàn)美元。
    （3）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡
    這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測(cè)，因而激發(fā)光照射光場(chǎng)為整個(gè)芯片區(qū)域，由CCD相機(jī)獲得整個(gè)DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強(qiáng)的高斯分布，會(huì)使得光場(chǎng)光強(qiáng)度分布不均，而熒光信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)，因而不利于信號(hào)采集的線性響應(yīng)。為保證激發(fā)光勻場(chǎng)照射，有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過(guò)傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上，照明面積可通過(guò)更換物鏡來(lái)調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用^[14].
    （4）光纖傳感器
    有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔。化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶液中的熒光信號(hào)基本不會(huì)傳播到光纖中，雜交到光纖遠(yuǎn)端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。

2.．生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)
     以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。

幾乎所有的檢測(cè)技術(shù)都可以用于基因芯片的檢測(cè)，比如常用的放射標(biāo)記技術(shù)，熒光標(biāo)記技術(shù)，質(zhì)譜分析，化學(xué)發(fā)光等等都行。但是如果檢測(cè)儀器的分辨率不高，那么即使點(diǎn)樣儀器制造出了很高密度的芯片也沒有用，檢測(cè)儀器的分辨率是基因芯片的重要瓶頸。在基因芯片的顯色和測(cè)定方法中又以熒光標(biāo)記技術(shù)最為常用。一般膜芯片的雜交都用同位素p32、p33作標(biāo)記，其信號(hào)的檢測(cè)需通過(guò)傳統(tǒng)的磷光成像系統(tǒng)來(lái)完成，
    使用熒光標(biāo)記的基因芯片，其檢測(cè)需要專用的熒光掃描儀測(cè)定。對(duì)于高密度的基因芯片目前最常用的是激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻CCD，二者各有利弊，須根據(jù)要求綜合衡量。其中又以高性能的冷卻CCD最為常用。
。
　　目前專用于熒光掃描的掃描儀大致分為兩類：一類是基于CCD（charge-coupled devices，電荷偶合裝置）的方法檢測(cè)光子；另一類則是基于PMT（photomultiplier tube，光電倍增管）的檢測(cè)系統(tǒng)。首先比較一下這兩種設(shè)備各自的優(yōu)缺點(diǎn)：
　　CCD一次可成像很大面積的區(qū)域，而以PMT為基礎(chǔ)的熒光掃描儀則是以單束固定波長(zhǎng)的激光來(lái)掃描，因此或者需要激光頭，或者需要目的芯片的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來(lái)使激光掃到整個(gè)面積，這樣就需要耗費(fèi)較多的時(shí)間來(lái)掃描；但是CCD有其缺點(diǎn)：目前性能最優(yōu)越的CCD數(shù)字相機(jī)的成像面積只有16×12mm（像素為10μm），因此要達(dá)到整個(gè)芯片的面積20×60mm的話，需要數(shù)個(gè)數(shù)碼相機(jī)同時(shí)工作，或者也可以以降低分辨率為代價(jià)來(lái)獲得掃描精度不是很高的圖像。　　生產(chǎn)商業(yè)化掃描儀的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Beecher Instruments公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon Instruments公司等。
5.基因芯片的應(yīng)用 

（一）基因表達(dá)分析　基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè)mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。與用單探針分析mRNA的點(diǎn)雜交技術(shù)不同，基因芯片表達(dá)探針陣列應(yīng)用了大約20對(duì)寡核苷酸探針來(lái)監(jiān)測(cè)每一個(gè)mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。每對(duì)探針中，包含一個(gè)與所要監(jiān)測(cè)的mRNA完全吻合和一個(gè)不完全吻合的探針（圖2），這兩個(gè)探針的差別在于其中間位置的核苷酸不同。這種成對(duì)的探針可以將非特異性雜交和背景訊號(hào)減小到最低的水平，由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的mRNA。目前，Affymetrix公司已經(jīng)生產(chǎn)出HugeneFL、Mu6500（含有小鼠6　500個(gè)基因）、Ye6100（含有酵母6　100個(gè)基因）等基因芯片成品。

  1　分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國(guó)劍橋大學(xué)Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人，應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應(yīng)用基因組水平的表達(dá)分析，監(jiān)測(cè)那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉(zhuǎn)錄因子TFIID和SAGA染色體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作用位點(diǎn)[15]。通過(guò)本試驗(yàn)，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控作用。（2）細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究人員進(jìn)一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的分子機(jī)制。
　　美國(guó)Stanford大學(xué)的V.R.Iyer等人[16]，對(duì)成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行了分析。首先，他們用成纖維細(xì)胞中的8　600個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過(guò)與mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA的雜交反應(yīng)，可以判斷出該基因的活性。在試驗(yàn)中，成纖維細(xì)胞被置于無(wú)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，使絕大部分基因的活性關(guān)閉，兩天后，加入10%的血清，24小時(shí)內(nèi)，分6個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測(cè)的基因中，約有500個(gè)基因最為活躍，而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。在活化的基因中，有28個(gè)基因共同作用，控制細(xì)胞的增殖；8個(gè)與免疫反應(yīng)的激活有關(guān)；19個(gè)與血管重建有關(guān)；另有許多基因，與血管新生密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，基因的表達(dá)與正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。通過(guò)基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜，有助于人類認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程和特征。

2 基因差異表達(dá)檢測(cè)〔17〕　生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問題。理解人類基因組中10萬(wàn)個(gè)不同的基因功能，監(jiān)測(cè)某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)（differential gene expression ，DGE）十分重要。對(duì)差異表達(dá)的研究，可以推斷基因與基因的相互關(guān)系，細(xì)胞分化中基因“開啟”或“關(guān)閉”的機(jī)制；揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前DGE研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）測(cè)序、差減克隆（subtractive cloning ）、差異顯示（differential display）、基因表達(dá)系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測(cè)大量mRNA的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測(cè)出極其微量的mRNA，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測(cè)胸膜間皮瘤與正常細(xì)胞間比較了6500個(gè)基因，，發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)差異基因的表達(dá)。其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng)RT-PCR進(jìn)行定量后，可作為胸膜間皮瘤診斷的標(biāo)記物（Markers）[18]。Sgroi〔19〕報(bào)告DNA芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection）用于乳癌浸潤(rùn)期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜（gene expression profiles）差異研究，結(jié)果被定量PCR和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞3萬(wàn)個(gè)基因與正常細(xì)胞的區(qū)別，有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和藥敏。最近，美國(guó)毒物化學(xué)研究所（CIIT） 和國(guó)家環(huán)境健康科學(xué)研究所（NIEHS）正計(jì)劃在一張玻片上建立8 700個(gè)小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我國(guó)也已成功研制出能檢出41 000種基因表達(dá)譜的芯片。美國(guó)Stanford大學(xué)的David Botstein利用cDNA微陣列芯片，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。利用基因芯片對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在60余萬(wàn)次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法，即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類。基因芯片技術(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。
    3　發(fā)現(xiàn)新基因　Moch等利用腫瘤微陣列芯片（5 184個(gè)cDNA片段）發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物基因，并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。在532份標(biāo)本中檢測(cè)到胞漿纖維Vimentin的表達(dá)基因，陽(yáng)性率為51%～61%〔20〕。追蹤觀察，有Vimentin表達(dá)的患者，預(yù)后極差。人類大量ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中400 000個(gè)ESTs代表了所有人類基因，成千上萬(wàn)的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析〔21〕。

定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和炎癥性腸病（IBD）的基因表達(dá)研究中，由RA或IBD組織制備探針，用Cy3和Cy5熒光素標(biāo)記，然后與靶cDNA微陣列雜交，可檢測(cè)出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如TNF-α、IL或粒細(xì)胞集落刺激因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子。Schena等人[22]報(bào)道了cDNA的微陣列在人類基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。采用含1,046個(gè)已知序列的cDNA微陣列，用高速機(jī)器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測(cè)不同基因表達(dá)，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，不同表達(dá)模式的陣列成分通過(guò)序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感10倍以上，檢測(cè)限度為1:500,000(wt/wt)總?cè)梭wmRNA。在培養(yǎng)T細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)17個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變，其中11個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo)，6個(gè)呈現(xiàn)中度抑制，對(duì)相應(yīng)于17個(gè)陣列成分的cDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)5個(gè)表達(dá)最高的成分是5種熱休克蛋白，17個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)3個(gè)新序列。另外，在佛波酯誘導(dǎo)檢測(cè)中[23]，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)陣列成分信號(hào)增強(qiáng)超過(guò)2倍，測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)比較揭示有5個(gè)已知的，誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè)是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1，有一個(gè)是未知的。這4個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對(duì)較低，僅呈現(xiàn)2倍的誘導(dǎo)。Northern雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測(cè)了人的骨髓、腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，4種組織中檢測(cè)出15種熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其表達(dá)水平與Jurkat細(xì)胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因β-actin和細(xì)胞色素C氧化酶在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測(cè)。目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中400,000個(gè)ESTs代表了所有人類基因，成千上萬(wàn)的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。
    4　大規(guī)模DNA測(cè)序　人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動(dòng)化操作的測(cè)序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測(cè)序（sequencing by hybridization, SBH）技術(shù)及鄰堆雜交（contiguous stacking hybridization, CSH）技術(shù)即是一種新的高效快速測(cè)序方法[24-26]。用含65 536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列，采用SBH技術(shù)，可測(cè)定200 bp長(zhǎng)DNA序列，采用67 108 864個(gè)13聚寡核苷酸的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA測(cè)序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。CSH技術(shù)彌補(bǔ)了SBH技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長(zhǎng)度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長(zhǎng)的DNA測(cè)序。計(jì)算機(jī)模擬論證了8聚寡核苷酸微陣列與5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當(dāng)于13聚寡核苷酸微陣列的作用，可測(cè)定數(shù)千個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA序列[26]。Dubiley等人[26]將合成的10聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列（fractionation chips）進(jìn)行單鏈DNA分離，再用測(cè)序微陣列（sequencing chips）分析序列，后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及與鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長(zhǎng)序列的DNA序列測(cè)定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測(cè)序的準(zhǔn)確率達(dá)99%以上。

正如NIH首腦Harold Varmus在美國(guó)細(xì)胞生物學(xué)1998年年會(huì)上所說(shuō)：“在基因芯片的幫助下，我們將能夠監(jiān)測(cè)一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所有基因的行為。”

（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析　

在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí)決定的，因此分析起來(lái)就十分困難，然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問題，利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。美國(guó)Stanford大學(xué)的E.A.Winzeler等[27]，以兩種不同菌株的酵母（S96和YJM789）作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)控制酵母對(duì)放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。將含有酵母150 000個(gè)DNA片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的mRNA分子雜交，S96幾乎全部吻合，而YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個(gè)位點(diǎn)沒有雜交顯色。由于S96對(duì)放線菌酮有抗藥性而YJM789的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所在。而后，通過(guò)對(duì)S96和YJM789雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析，進(jìn)一步確定，控制該抗藥性的基因位于15號(hào)染色體，是一長(zhǎng)約57 000個(gè)堿基的片斷。美國(guó)國(guó)家人類基因組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協(xié)助下[28]，將基因芯片應(yīng)用于雙色突變分析。他們的分析對(duì)象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的BRCA1基因的外顯子11。在擴(kuò)增后，將BRCA1基因的外顯子11置于含有熒光素-12-UTP的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA與BRCA1外顯子11芯片雜交，4小時(shí)后，用藻紅蛋白染色。在觀察時(shí)，用488nm的氬離子激光進(jìn)行掃描，熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈現(xiàn)紅色。應(yīng)用雙色分析，可以更為清楚的監(jiān)測(cè)未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競(jìng)爭(zhēng)性雜交情況，進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過(guò)對(duì)15名患者BRCA1基因的觀察，有14名患者在外顯子11位點(diǎn)存在不同的突變。Hacia等［29］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個(gè)長(zhǎng)度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1～5 bp)突變。針對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)，共有28個(gè)獨(dú)立的探針，14個(gè)針對(duì)有義鏈，14個(gè)針對(duì)反義鏈。14個(gè)探針包括2個(gè)野生型，3個(gè)堿基置換、4個(gè)插入突變、5個(gè)堿基缺失。在15例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變，類型包括點(diǎn)突變、插入及缺失等；在20例對(duì)照樣品中均未檢出假陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)果表明DNA芯片技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等［30］分別用兩種DNA芯片檢測(cè)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)的突變，其中一個(gè)芯片包含1 480個(gè)探針，檢測(cè)了CFTR基因的第10和11外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了10個(gè)未知樣品的CFTR基因，其結(jié)果與PCR-RELP的分析結(jié)果完全一致。

Guo等人[31]利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ASOs）微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價(jià)固定于玻璃載片上，采用PCR擴(kuò)增基因組DNA，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈，將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交，通過(guò)熒光掃描檢測(cè)雜交模式，即可測(cè)定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對(duì)人的酪氨酸酶基因等4個(gè)外顯子內(nèi)含有的5個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。β-地中海貧血中變異的檢測(cè)也論證了該方法的有效性和可信性[32]。Lipshutz等人[33]采用含18,495個(gè)寡核苷酸探針的微陣列，對(duì)HIV-1基因組反轉(zhuǎn)錄酶基因（rt）及蛋白酶基因（pro）的高度多態(tài)性進(jìn)行了篩選。微陣列中內(nèi)部探針與靶序列的錯(cuò)配具有明顯的不穩(wěn)定性，據(jù)此可快速區(qū)別核酸靶的差異。例如檢測(cè)序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X堿基的種類，可用下列4種探針3'AGTCGTAACGGTAGC，3'AGTCGTACCGGTAGC，3'AGTCGTAGCGGTAGC，3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探針陣列可檢則具有特征性的較長(zhǎng)序列相關(guān)的多態(tài)性與變異。篩選1,000個(gè)核苷酸序列的變異與多態(tài)性需要4,000個(gè)探針。用100μm合成位點(diǎn)，設(shè)計(jì)1.28cm2陣列，將有大約16,000個(gè)探針，能篩選4kb序列。HIV-1基因組中rt與pro在疾病過(guò)程中易于發(fā)生多種變異，這些變異將導(dǎo)致病毒對(duì)多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現(xiàn)明顯抗性，因此檢測(cè)和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析將越來(lái)越重要。Chee等［34］用含有1.35×105個(gè)長(zhǎng)度為25 nt的寡核苷酸探針，分析了16.6 kb的人類線粒體基因組DNA(mt DNA)，共分析了10個(gè)樣本，檢測(cè)出了505個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并在Leber′s遺傳性視神經(jīng)疾病患者的mt DNA中檢測(cè)出3個(gè)致病性突變位點(diǎn)。

隨著人類基因組計(jì)劃的逐步發(fā)展，研究人員分析出了越來(lái)越多的基因序列。下一步，就是要分析這些基因的多態(tài)性與生物功能和疾病的關(guān)系，而這需要對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行分析。通過(guò)基因芯片SNP（單核苷酸多態(tài)性）定位試驗(yàn)，可以確定基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系，同時(shí)也可確定致病的機(jī)制和病人對(duì)治療的反應(yīng)等。同樣，對(duì)于許多與人類疾病密切相關(guān)的致病微生物，也可對(duì)其進(jìn)行基因型和多態(tài)性分析，1998年，法國(guó)T.Livache等[35]就成功的利用基因芯片技術(shù)，對(duì)人血中的HCV病毒進(jìn)行了基因型分析。SNP基因芯片的成功將使臨床診斷上到一個(gè)新的臺(tái)階。

（三）疾病的診斷與治療　人類的疾病與遺傳基因密切相關(guān)，基因芯片可以對(duì)遺傳信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，因此它在疾病的分子診斷中的優(yōu)勢(shì)是不言而喻的，就臨床一種新的、強(qiáng)有力的分子工具[36]。基因芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。
　　1　遺傳病相關(guān)基因的定位　90年代以來(lái),隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展,各種方法被相繼創(chuàng)立并應(yīng)用到基因定位中。我國(guó)有4 000萬(wàn)育齡婦女，每年有2 000萬(wàn)新生兒，準(zhǔn)確檢測(cè)遺傳病基因是優(yōu)生優(yōu)育的技術(shù)保障。DNA芯片充分結(jié)合并靈活運(yùn)用了大規(guī)模集成電路制造技術(shù)、自動(dòng)化技術(shù)、計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標(biāo)記探針、分子雜交及分子生物學(xué)的其它技術(shù),在這一領(lǐng)域的研究中有著巨大的潛力。這一技術(shù)已成為基因定位研究的高效工具。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加，變異與多態(tài)性分析將越來(lái)越重要。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經(jīng)濟(jì)快速又敏感可靠[37,38]。
    2　腫瘤診斷　已用基因芯片檢測(cè)人鼻咽癌、肺癌基因表達(dá)譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和定位。早在1996年，M.J.Kozal等就利用基因芯片[39]，對(duì)HIV-I B亞型中的蛋白酶基因的多態(tài)性進(jìn)行了分析，這也是基因芯片技術(shù)被首次應(yīng)用于臨床實(shí)踐。在艾滋病的治療中，使用HIV蛋白酶抑制劑是一種重要的手段。然而，病毒對(duì)該藥物的反應(yīng)卻有著很大的差異。利用基因芯片技術(shù)，研究人員分析了取自102個(gè)病人的167個(gè)病毒單體，發(fā)現(xiàn)這些同為美國(guó)HIV-I B亞種的病毒的基因序列存在極大差異，其中蛋白酶的基因片斷差異最大，在編碼99個(gè)氨基酸的序列中，竟有47.5%存在明顯突變。這些氨基酸的突變，直接導(dǎo)致了病毒抗藥性的不同。含96 600個(gè)20體寡核苷酸高密度陣列對(duì)遺傳性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11個(gè)外顯子進(jìn)行雜合變異篩選，15個(gè)患者的已知變異的樣品中，準(zhǔn)確診斷出14個(gè)患者，20個(gè)對(duì)照樣品中未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP調(diào)查42例有乳癌史的家系，p53基因13 964位的G變?yōu)镃，突變率為7.1%；無(wú)乳癌家族史者為0。Favis等用多位PCR/連接酶檢測(cè)反應(yīng)（PCR/LDR）在一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)數(shù)百個(gè)基因突變，用于檢測(cè)大腸癌組織k-ras 和p53突變及BRCA-1和BRCA-2低頻率突變收到良好效果。
    人類惡性腫瘤中，約有60%與人類p53抑癌基因的突變有關(guān)，目前研究人員已經(jīng)研制成功了可以檢測(cè)p53基因所有編碼區(qū)（外顯子2～外顯子11）錯(cuò)意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。以外顯子7的第248個(gè)密碼子為例，野生型為CGG，在芯片上做出5條探針，相應(yīng)位點(diǎn)分別為GAC、GCC、GGC、GTC和G-C，根據(jù)雜交后的熒光顯色圖，就可以分析出該位點(diǎn)為何種突變。

3　感染性疾病的診斷　HIV-1基因組中rt與pro在疾病過(guò)程中易于發(fā)生多種變異，這些變異將導(dǎo)致病毒對(duì)多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現(xiàn)明顯抗性，因此檢測(cè)和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。Hayward[40]以3 648個(gè)插入片段建立獵槍微陣列(shotgun microarray)，通過(guò)差異雜交和DNA測(cè)序找到了瘧原蟲無(wú)性和有性生殖階段基因差異表達(dá)，為抗瘧藥設(shè)計(jì)提供了線索。可以預(yù)測(cè)在不久的將來(lái)，人們可望在一張DNA芯片上檢測(cè)幾乎所有的病原微生物基因，實(shí)現(xiàn)真正意義上的“組合檢測(cè)（profile tests）”。
    4　耐藥菌株和藥敏檢測(cè)　據(jù)WHO報(bào)告，全球每年約有800萬(wàn)結(jié)核病患者，有300萬(wàn)人死亡，死亡人數(shù)超過(guò)了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對(duì)不同的藥物產(chǎn)生了抗藥性（俄國(guó)80%TB對(duì)一種藥物產(chǎn)生抗性；美國(guó)50%為多重耐藥）。對(duì)每例患者進(jìn)行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關(guān)鍵。最近，俄美兩國(guó)科學(xué)家開發(fā)了具此功能的基因芯片，可使醫(yī)生及早使用敏感藥物。該芯片（TB Biochips）將抗性菌株的單鏈DNA標(biāo)記后固定在玻片上，與待檢TB株雜交，臨床使用未見假陽(yáng)性，該芯片可清洗后重復(fù)使用50次。
    （四）藥物研究中的應(yīng)用

從經(jīng)濟(jì)效益來(lái)說(shuō)，最大的應(yīng)用領(lǐng)域可能是制藥廠用來(lái)開發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開發(fā)。如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。對(duì)于尋找新藥來(lái)說(shuō)，目標(biāo)之一是應(yīng)用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)。采用所謂“譯碼器”策略（Decoder strategy）來(lái)確定藥物靶標(biāo)。從而找到“導(dǎo)向藥物”。基因芯片也被用于尋找蛋白激酶抑制物。細(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。
    1 新藥開發(fā)　高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)。噬菌體展示技術(shù)可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì)，目前多用于抗體庫(kù)的建立和篩選，進(jìn)而可用于受體-配體相互作用的研究。基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)（bioinformatics）將大大促進(jìn)制藥工業(yè)的發(fā)展。目前第一個(gè)生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療，并獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)。除腫瘤外，用分子生物工程設(shè)計(jì)的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設(shè)計(jì)新的抗生素和工業(yè)用酶等。

同時(shí)，有時(shí)一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新的功能。原先設(shè)想的作用是針對(duì)某一靶標(biāo)的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強(qiáng)的抑制作用，從而開發(fā)成另一種新藥。

2 調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況
　　基因芯片在用來(lái)研究藥物的作用機(jī)理時(shí)十分有用。Marton[40]等人利用基因芯片構(gòu)建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細(xì)胞后的基因表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)用FK506處理的酵母細(xì)胞基因表達(dá)圖譜與FK506靶標(biāo)的無(wú)意義突變體相似。而用FK506去處理此突變體，發(fā)現(xiàn)了不同于野生型的作用機(jī)制。Clarke等［41］用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達(dá)增加。該研究提示，這類研究既有助于闡明藥物的作用機(jī)制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。
    3 對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)
　　應(yīng)用芯片查找藥物的毒性或副作用，進(jìn)行毒理學(xué)研究。尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表達(dá)的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達(dá)，則對(duì)它的深入研究就值得考慮。用芯片作大規(guī)模的表達(dá)研究往往可省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)。若某個(gè)正在篩選的潛在藥物作用靶細(xì)胞得到的基因表達(dá)圖譜與已知的具有毒性副作用的藥物得到的基因表達(dá)圖譜相似時(shí)，就要考慮是否停止藥物開發(fā)（drug development）中花費(fèi)巨大的臨床實(shí)驗(yàn)階段。Nuwaysir等［42］研制了包括涉及細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、氧化應(yīng)激/氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、過(guò)氧化物酶體增殖反應(yīng)、二英/多環(huán)芳烴反應(yīng)、雌激素反應(yīng)、看家基因、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細(xì)胞色素P450等共2 090個(gè)基因的毒理芯片(ToxChip v1.0), 該芯片既可用于毒物的檢測(cè)和遺傳多態(tài)性的檢測(cè)，又可用于受檢毒物的毒作用機(jī)制的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫(kù)中選擇約600個(gè)與毒理學(xué)相關(guān)基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的毒理基因組學(xué)芯片，可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點(diǎn)的作用機(jī)制，也可用于確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性。

（五）基因芯片中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

中醫(yī)學(xué)中應(yīng)用基因芯片技術(shù)，還處于初始階段，目前主要集中以下三個(gè)方面：

1中藥的研究，具體的方法，同上述藥物篩選方法類似。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學(xué)過(guò)程均被大大簡(jiǎn)化，將推動(dòng)中藥的迅猛發(fā)展。中藥學(xué)引入基因芯片技術(shù)，將大大推動(dòng)中藥研究的國(guó)際化進(jìn)程，為闡明中藥作用機(jī)理，具有無(wú)可估量的重要意義。

2中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究。中醫(yī)“證”的中醫(yī)藥的臨床治療的核心，但“證”的本質(zhì)研究一直難以有重大進(jìn)展。主要因?yàn)橹嗅t(yī)理論設(shè)及到生命的整體，因而它牽涉到許多基因和蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的方法學(xué)無(wú)法弄清“證”的實(shí)質(zhì)，而利用基因芯片技術(shù)，對(duì)不同“證”狀態(tài)的基因組進(jìn)行掃描，再繪出不同證的基因表達(dá)譜，通過(guò)相關(guān)分析，可望獲得一些有意義的成果。也是從分子基因水平全面揭示“證”本質(zhì)提供了可能。如果證本質(zhì)被揭示，它可能會(huì)引起醫(yī)學(xué)治療學(xué)理論的重大革新或變化，尤其是個(gè)體化治療方案可能重新被重視。

3針灸原理研究。針灸的原理設(shè)及全身各個(gè)部分，針灸不同方法、不同穴位、經(jīng)絡(luò)是否具有不同的作用，也即經(jīng)脈與臟腑間的相關(guān)聯(lián)系是否具有相對(duì)特異性。通過(guò)基因芯片測(cè)量不同組織基因表達(dá)的差異，判斷基因表達(dá)是否具有特異性，有望解決這一長(zhǎng)期爭(zhēng)論不休的問題。如果心經(jīng)與心臟具有相對(duì)特異性，那么針刺心經(jīng)后，心臟內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)某些與針刺相關(guān)的特異性基因表達(dá)，而且，這種表達(dá)只在針刺心經(jīng)時(shí)出現(xiàn)，這些基因可能不在其它器官，如肝臟中表達(dá)。那么可以肯定地認(rèn)為經(jīng)脈臟腑相關(guān)是具有相對(duì)特異性的，也可以認(rèn)為傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)理論是有依據(jù)的。

另一方面，基因芯片還有助于揭示針灸的作用機(jī)制。針灸的作用是與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)（NEI networks）密切相關(guān)的，它設(shè)及到細(xì)胞信使、神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素等多種因子，但針灸的信號(hào)是如何在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)傳遞的過(guò)程仍不明朗，如果引入基因芯片，可以高通量的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的時(shí)空特征，有助于了解針灸促進(jìn)基因表達(dá)的特點(diǎn)，進(jìn)而再利用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)，揭示針灸作用原理。現(xiàn)在已有部分工作正在進(jìn)行。

    （六）其它應(yīng)用

  1環(huán)境化學(xué)毒物的篩選　我們的生活環(huán)境中存在著數(shù)千種化學(xué)物質(zhì)，每種物質(zhì)在投入使用前必須進(jìn)行人體毒性試驗(yàn)，傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)費(fèi)用高昂，且存在著國(guó)際上關(guān)注的動(dòng)物福利（animal welfare）問題。采用毒物檢測(cè)芯片（Toxchips）可對(duì)環(huán)境中眾多化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類基因的潛在毒性進(jìn)行篩選，探查毒物“開啟”或“關(guān)閉”哪些基因，研究“環(huán)境如何改變我們的基因”。NIEHS將對(duì)人類100 000個(gè)基因中的12 000個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，弄清致癌物質(zhì)對(duì)基因的改變，建立化學(xué)物質(zhì)指紋庫(kù)（fingerprints of chemicals），然后即可通過(guò)測(cè)定特定基因的突變與否判斷新的合成物質(zhì)的生物毒性。

  2體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究。體質(zhì)醫(yī)學(xué)關(guān)系到個(gè)體化治療的核心問題，不同的人具有不同的體質(zhì)基礎(chǔ)，其原因與基因型可能存在一定的相關(guān)性，尤其可能與SNP關(guān)系較大，如何全面了解人的SNP差異，以及它與體質(zhì)因素、疾病的易感性間關(guān)系，是值得研究的重大課題。

posted on 2007-04-28 11:10 ashura 閱讀(1829) 評(píng)論(0)  編輯 收藏 引用 所屬分類: Bioinformation